番红-O铜绿软骨染色法的原理是嗜碱性的软骨与碱性染料番红O结合呈现红色，嗜酸性的骨和酸性染料固绿结合而成绿色或蓝色，与呈现红色的软骨对比鲜明，从而将软骨组织与骨组织区分开。番红O是一种结合多阴离子的阳离子染料，其显示软骨组织是基于阳离子染料与多糖中阴离子基团结合。番红O着色与阴离子的浓度近似成正比关系，间接反映了基质中蛋白多糖的含量和分布。当软骨收到损伤时，软骨中的糖蛋白会释放出来，使基质成分分布不均匀，从而导致番红O淡染或不着色。番红O-固绿染色的分化很关键，分化过度易导致切片不着色，分化不足易导致切片着色过深。